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本试剂盒用于从各种植物中提取纯化高品质总RNA，也适用于真菌菌丝RNA的提取。独特的Shredder分离柱，用于匀质化和过滤高粘度的植物或真菌裂解物，同时采用硅基质膜吸附RNA进行纯化，使多聚糖等各种污染物通过洗涤被有效去除，经洗脱的RNA可直接用于各种下游实验。由本试剂盒提取RNA分子量大于200碱基，纯度高，几乎无DNA残留。如果是对微量DNA非常敏感的RNA实验，残留的DNA可利用无RNase的DNase I在柱上进行消化去除。提取的RNA可用于Northern Blot、Dot Blot、RT-PCR和体外翻译等实验。

• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
    
  • 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
  • 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
• 提取的样品避免反复冻融，否则影响RNA提取的量和质量。
  
• Buffer RL在使用前请加入β-巯基乙醇，至终浓度为1%。如1mL Buffer RL加10μL β-巯基乙醇。加入β-巯基乙醇的Buffer RL室温可保存1个月。Buffer RLC使用时不需加β-巯基乙醇。
  
• 第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明先在Buffer RW2中加入无水乙醇。
  
• Buffer RL和Buffer RLC如果产生沉淀，请加热使其溶解后室温放置。
  
• 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。
  
• 若下游实验对DNA非常敏感，建议用RNase-free DNase I(货号：WE0213)对RNA进行处理。

• 取植物新鲜组织50～100mg，加入液氮迅速研磨成粉末。
  
• 将研磨后的粉末收集到离心管（自备）中，加入600μL Buffer RL（使用前检查是否加入β-巯基乙醇）或Buffer RLC，涡旋振荡使其充分裂解。
  注意：
  
  • Buffer RL主要成分为异硫氰酸胍，适用于大多数植物组织的裂解。但有些植物组织（如玉米的胚乳），由于次级代谢产物较特殊，异硫氰酸胍使样品产生沉淀，导致RNA提取效果不佳，此时可加入Buffer RLC替代Buffer RL。
    
  • 56℃孵育1～3分钟有助于组织的裂解，但是淀粉含量高的植物不要进行高温孵育。
• 将步骤2所得全部液体转移至已装入收集管的过滤柱FL中，12000rpm（~13400×g）离心2分钟，将收集管中的上清液转移到一个新的离心管（自备）中。
  注意：
  
  • 在吸取液体时可以将枪头尖端剪掉，便于取样。
    
  • 吸附柱FL可以除去大部分的碎片，但仍会有小部分流出，离心后会在收集管内形成沉淀，在进行下一步时注意避免吸到沉淀。
• 在步骤3所得干净的裂解液中加入0.5倍体积的无水乙醇，迅速混匀。
  注意：加入乙醇后可能会产生沉淀，但不影响后续试验。
  
• 将步骤4得到的溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱RM中，若一次不能将全部溶液加入吸附柱中，请分两次转入。12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1，12000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  可选步骤：如果要进行对微量DNA非常敏感的RNA实验，则用以下步骤替代步骤6。
  
  • 向吸附柱中加入350μL Buffer RW112000rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
    
  • 配制DNase I混合液：取52μL RNase-Free Water，向其中加入8μL 10×Reaction Buffer和20μL DNase I (1U/μL)，混匀，配制成终体积为80μL的反应液。
    注意:以上体系为按照我公司产品RNase-free DNase I(货号：WE0213)反应体系进行配置，应用其他公司产品请参考相应说明书。
    
  • 向吸附柱中直接加入80μL DNase I反应液，20～30℃孵育15分钟。
    
  • 向吸附柱中加入350μL Buffer RW112000rpm离心15秒，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。
• 向吸附柱中加入500μL Buffer RW2（使用前检查是否加入无水乙醇）,12000rpm离心15秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 重复步骤7。
  
• 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干吸附柱中的无水乙醇。
  注意：这一步的目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续的酶促反应(酶切、PCR等)。
  
• 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位悬空加入30～50μL RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
  注意：
  
  • RNase-Free Water体积不应小于30μL，体积过小影响回收率。
    
  • 如果要提高RNA的产量，可用30～50μL新的RNase-Free Water重复步骤10。
    
  • 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤10。